Biologi Molekular

Pengklonan

Ø  Pengklonan (cloning) merupakan perbanyakan salinan dari DNA yang telah direkayasa.

Ø Tujuan: mengisolasi gen atau fragmen DNA yang diinginkan dari suatu organisme dan mengintroduksinya ke dalam sel inang, sehingga dihasilkan dalam jumlah banyak.

Tahapan :

1. Enzim restriksi : Enzim yang memotong untaian DNA secara spesifik sesuai dengan urutan yang dikenalinya/sekuens pengenalan (recognition site), Disebut juga gunting molekuler. Sekuens pengenalnya sepanjang 4-8 nukleotida. Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa. Enzim restriksi sifat palindromik. Enzim restriksi yang mempunyai situs pengenalan yang sama = isoschizomers.
2. Enzim Ligase : Enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara gugus 3’hidroksil pada fragmen DNA dengan gugus 5’ fosfat pada DNA vektor. Berfungsi sebagai lem molekuler. Diproduksi dari T4 bacteriophage.
3. Vektor : Merupakan molekul DNA yang disisipi fragmen DNA asing yang diligasikan ke dalamnya. Karakteristik vektor yang baik :Stabil, Mudah diisolasi, Dapat bereplikasi sendiri,, Polylinker, Mudah diintroduksi ke sel inang, Mudah dideteksi, Sirkuler, dsDNA.
4. Introduksi rekombinan DNA ke sel inang :  Sel inang terdiri dari :  Bakteri, yeast, tumbuhan, hewan. Transformasi: Alami dan perlu perlakuan khusus
5. Seleksi/screening :  Media kultur hasil pengklonan  ditambahkan antibiotik. Hibridisasi (mengidentifikasi klon yang membawa rekombinan DNA).

Prinsip dasar PCR :

1. Denaturasi : Proses pemisahan DNA template untai ganda (double stranded) menjadi tunggal (single stranded). Dilakukan dengan menggunakan suhu 95°C selama 1-2 menit.
2. Renaturasi/Annealing:  Suhu diturunkan menjadi 55°C, primer akan “menempel” (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal.
3. Ekstensi/Extension/Elongation: Suhu inkubasi dinaikkan 72°C selama 1,5 menit. DNA polimerase melakukan proses polimerasi/sintesis rantai DNA yang baru, dimulai dari primer.

 

        Blotting adalah Teknik biologi molekuler yang digunakan untuk mempelajari ekspresi gen, dengan mendeteksi DNA, RNA atau protein pada sampel.

- Blotting:

•  Dot blot

•  Southern blot = Deteksi DNA

•  Northern blot = Deteksi RNA

•  Western blot= Deteksi Protein

           Sequencing DNA adalah metode mengetahui urutan nukleotida dari DNA klon.

Tahapan reaksi sequencing:

1.     Pemisahan untai DNA sebagai template

2.     Primer annealing

3.     Primer extension

4.     Termination

Denaturasi : Pemisahan rantai2 komplemeter molkr DNA dg pemnasan

Autoradiografi : Teknik mendeteksi keberadaan molkl DNA berlabael radioaktif dgn xrayfilm

Rekstriksik Endonuklease : enzim2 bakteri yg memutuskan ikatan fosfodiester dlm DNA pd sekuen2 spesifik.

PCR : metode enzimatis untuk melipat gandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu secara in vitro.

Enzim yg digunakan pd proses PCR Taq DNA Polimerase, Tth DNA Polimerase, Pwo DNA Polimerase, Pfu dan Tli DNA Polimerase.

Probe/kuar Merupakan molekul DNA atau RNA untai tunggal yang telah diketahui urutannya, guna mengidentifikasi/mengkarakterisasi DNA target.

Western Blotting : Teknik biologi molekuler untuk mendeteksi molekul protein pada sampel. Identifikasi protein didasari pada kemampuan antigen melekat pada antibodi yang spesifik.

Elektroforesis : Memisahkan DNA vektor dari fragmen terklon memotong rekombinan DNA enzim restriksi elektroforesis gel memisahkan molekul DNA berdasarkan panjang basa (base pair/bp).